表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建

doi:10.3969/j.issn.1672-5069.2010.03.001

实用肝脏病杂志 ›› 2010, Vol. 13 ›› Issue (3): 161-165.doi: 10.3969/j.issn.1672-5069.2010.03.001

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表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建

胡斌，杨燕，刘嘉，马智勇，黄红平，余源，刘慎沛，杨东亮

430030 武汉市华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室（胡斌，刘嘉，马智勇，杨东亮）；实验医学研究中心（杨燕，黄红平，余源，刘慎沛）

收稿日期:2010-03-25 出版日期:2010-06-10 发布日期:2016-04-18
通讯作者: 杨燕，E-mail:yyang@tjh.tjmu.edu.cn
作者简介:胡斌男，28岁，博士研究生
基金资助:
国家传染病防治科技重大专项（2008ZX10002-011）；国家高技术研究发展计划（863）项目（2006AA02Z128）；国家自然科学基金（30700701）

Inhibition of HbsAg and HbeAg expression of recombinant adeno-associated virus encoding HBsAg-shRNA in HepG2.215 cells in vitro

HU Bin，YANG Yan，LIU Jia，et al.

Institute of Clinical Immunology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Received:2010-03-25 Online:2010-06-10 Published:2016-04-18

摘要/Abstract

摘要： 目的构建表达针对HBsAg小发卡RNA（shRNA）的重组腺相关病毒载体，以观察该病毒在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用。方法将表达针对HBsAg的shRNA定向克隆到pAAV/U6-hrGFP 质粒中，获得重组表达质粒（pAAV-shHBs-hrGFP）；采用磷酸钙转染法将该质粒与包装质粒 pAAV-RC 和辅助质粒 pHelper 共同转染AAV 293 细胞，进行rAAV-shHBs-hrGFP 重组病毒包装。收获病毒感染HepG2.215细胞；采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平。结果酶切鉴定、测序结果表明，pAAV-shHBs-hrGFP 载体成功构建。包装收获的rAAV-shHBs-hrGFP病毒液可以感染HepG2.215细胞，并且可以抑制HBsAg和HBeAg的表达。结论制备的 rAAV-shHBs-hrGFP病毒载体能够抑制HBV 在体外的抗原表达。

关键词: HepG2.215细胞, 腺相关病毒2, RNA干扰, HBsAg

Abstract: Objective To construct the recombinant adeno-associated virus（rAAV）encoding HBsAg-shRNA and to observe its effect on HBsAg and HBeAg expression in HepG2215 cells in vitro. Methods pAAV-shHBs-hrGFP expressing plasmid was constructed by molecular biological techniques. The recombinants were cotransfected with p-RC and p-Helper into AAV-293 cells mediated by calcium acid phosphate. The rAAVs encoding HBsAg-shRNA（rAAV-shHBs-hrGFP）were harvested and infected HepG2215 cells. The silencing effect of this virus on HbsAg and HBeAg gene expression was assessed by ELISA. Results The plasmid of pAAV-shHBs-hrGFP was successfully constructed by identification of restrict enzyme and DNA sequencing. GFP expression was observed about 80% in AAV-293 cells. After cotransfection，the recombinant AAV-shHBs-hrGFP was harvested and the virus titer was tested. The HBsAg and HBeAg expression in HepG2.215 cells was down-regulated markedly after infection of rAAV-shHBs-hrGFP. Conclusion The recombinant AAV-shHBs-hrGFP vector is successfully constructed and can be used as a potential antivirus agent to inhibit HBV replication.

Key words: HepG2215 cells, AAV2, RNAi, HBsAg

胡斌，杨燕，刘嘉，马智勇，黄红平，余源，刘慎沛，杨东亮. 表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建[J]. 实用肝脏病杂志, 2010, 13(3): 161-165.

HU Bin，YANG Yan，LIU Jia，et al.. Inhibition of HbsAg and HbeAg expression of recombinant adeno-associated virus encoding HBsAg-shRNA in HepG2.215 cells in vitro[J]. JOURNAL OF PRACTICAL HEPATOLOGY, 2010, 13(3): 161-165.

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